SMN1基因外顯子缺失檢測試劑的(de)臨床價值及相關産品審評情況
脊髓性肌萎縮症（spinal muscular atrophy，SMA）是一種常染色體隐性遺傳病，居兒(ér)童緻死性常染色體隐性遺傳病的(de)第 2 位。位于染色體 5q11.2~q13.3 上的(de)運動神經元存活基因（Survival motor neuron，SMN）是 SMA 的(de)主要緻病基因。
人(rén)基因組有兩個(gè)緊鄰的(de)高(gāo)度同源的(de) SMN 基 因：端粒側的(de) SMN1 和(hé)著(zhe)絲粒側的(de) SMN2，兩者僅有 5 個(gè)堿基不同。SMNl 是主要功能基因，該基因突變可(kě)導緻 SMA 發病，SMN2爲臨床表型的(de)調節基因，影(yǐng)響病情的(de)嚴重程度，其拷貝數增加可(kě)減輕SMA 表型。目前已知約 94％的(de) SMA患者爲 SMNl 基因第 7 和(hé)（或）第 8外顯子純合缺失所緻，少數病例可(kě)由SMN1 基因點突變或小的(de)缺失引起。
SMN1 基因外顯子缺失檢測在 SMA 診斷中的(de)意義
SMA 以脊髓前角運動神經元退化(huà)變性爲特征，臨床表現爲進行性、對(duì)稱性四肢近端和(hé)身體軀幹肌肉無力、萎縮和(hé)癱瘓。根據發病年齡和(hé)肌無力嚴重程度，臨床上将 SMA 分(fēn)爲 I、Ⅱ和(hé)Ⅲ型，即嬰兒(ér)型、中間型和(hé)少年型，嚴重程度依次遞減。一般的(de)，神經專科醫生根據發病年齡、臨床表現及病情進展程度進行臨床診斷，輔助檢查方法包括肌電圖、肌酶和(hé)肌肉活檢，結合家族史和(hé) SMN1 基因分(fēn)析可(kě)進行确診。肌電圖是定位診斷，特異度不高(gāo)；肌酶在鑒别其他(tā)肌無力疾病中有參考意義，但對(duì) SMA診斷無特異性；肌肉活檢由于取材的(de)創傷性，患兒(ér)不易接受。由于 SMA患兒(ér)中約 94% 爲 SMN1 基因外顯子純合缺失，因此 SMN1 基因缺失檢測對(duì)于 SMA 的(de)診斷具有更高(gāo)的(de)靈敏度和(hé)特異性，且對(duì)不同型的(de) SMA 患者，SMN1 純合缺失率沒有顯著差異，也(yě)就是說 SMN1 純合缺失的(de)檢測對(duì)于不同型 SMA 患者具有相同的(de)臨床診斷價值；同時(shí)與有創的(de)組織學診斷相比，基因檢測更易被接受。事實上，在歐美(měi)人(rén)群中，SMN1 基因純合缺失檢測已成爲診斷和(hé)排除診斷 SMA 的(de)首選方法。
SMN1 基因外顯子缺失檢測在産前診斷和(hé)篩查中的(de)意義
SMA 在 人(rén) 群 中 的(de) 發 病 率 爲 1/5 000~1/10 000，群體攜帶者頻(pín)率爲 1/35~1/50，是出生缺陷的(de)高(gāo)危因素。由于該病嚴重危害人(rén)類健康，且基因位點明(míng)确，因此極有必要進行SMA 攜帶者的(de)人(rén)群篩查。通(tōng)過 SMN1基因外顯子雜(zá)合缺失突變的(de)檢查可(kě)确認無症狀的(de)攜帶者。當夫妻雙方均爲攜帶者時(shí)，可(kě)對(duì)其進行遺傳咨詢，評估生育患兒(ér)的(de)遺傳風險，并可(kě)以通(tōng)過産前診斷技術降低人(rén)群中 SMA 患兒(ér)的(de)出生率。在歐美(měi)等國家很早就建議(yì)在普通(tōng)人(rén)群中進行 SMA 攜帶者的(de)篩查。
但在 SMA 患兒(ér)臨床診斷和(hé) SMA攜帶者篩查中，對(duì) SMN1 基因外顯子缺失檢測的(de)要求是截然不同的(de)，前者僅需準确檢測出 SMN1 基因外顯子純合缺失，後者則需要鑒别 SMN1 基因外顯子雜(zá)合缺失。
SMN1 基因缺失檢測試劑的(de)現狀
目前，SMN1 基因外顯子缺失檢測試劑較爲缺乏。臨床檢驗實驗室較爲公認的(de)方法是 PCR 結合限制性片段長(cháng)度多(duō)态性（PCR-RFLP）的(de)方法，但該方法操作較爲繁瑣，且重複性差，不利于标準化(huà)，不易推廣。這(zhè)種方法隻能檢測出純合缺失，無法确認雜(zá)合缺失。
荷蘭的(de) SMA MLPA 檢測試劑可(kě)對(duì)待測靶序列進行半定量分(fēn)析，因此既可(kě)檢測純合缺失，亦可(kě)确認雜(zá)合缺失。在國内外已有多(duō)篇文獻報道采用(yòng)該方法進行 SMA 患者診斷和(hé) SMA 攜帶者篩查。但該産品目前仍爲“僅用(yòng)于研究”的(de)試劑，尚未按照(zhào)體外診斷類醫療器械上市（98/79/EC）。
2015 年底，CFDA 批準了(le)第一項SMN1 缺失突變檢測試劑上市。該産品采用(yòng)多(duō)重實時(shí)熒光(guāng) MGB-TaqMan探針 PCR 法，以人(rén)基因組單拷貝基因 RPP40 爲内參基因，對(duì) SMN1 基因第 7 外顯子和(hé)第 8 外顯子拷貝數進行相對(duì)定量檢測，用(yòng)于脊肌萎縮症（SMA）患者的(de)體外輔助分(fēn)子診斷。SMN1 基因外顯子缺失檢測的(de)難點之一在于排除高(gāo)同源性基因 SMN2 的(de)幹擾，特别是對(duì)于 SMN2 高(gāo)拷貝數的(de)受試者，需保證結果的(de)準确可(kě)靠。該産品通(tōng)過對(duì)實時(shí)熒光(guāng) PCR 相對(duì)定量、絕對(duì)定量技術進行系統整合，并在反應體系中加入特定化(huà)學組份，以抑制PCR 引物(wù) 3’端的(de)胞嘧啶（C）與胸腺嘧啶（T）的(de)錯配，增加 PCR 擴增的(de)特異性，從而有效控制 SMN2 基因非特異性擴增對(duì)檢測結果的(de)影(yǐng)響，準确檢出高(gāo)拷貝數 SMN2 樣本中 SMN1基因第7外顯子和(hé)第 8外的(de)缺失情況。
鑒于國内外尚無任何按照(zhào)體外診斷試劑批準上市的(de)SMA 分(fēn)子診斷産品，因此臨床試驗方案中依據 EMQN 關于《SMA 分(fēn)子診斷最佳實踐指南(nán)》，采用(yòng)了(le)國内外SMA 體外輔助分(fēn)子診斷領域公認的(de)PCR-RFLP 法作爲對(duì)照(zhào)方法。臨床試驗共完成 1069 例，其中正常對(duì)照(zhào)組777 例，SMA 病例組 292 例，統計分(fēn)析結果顯示申報産品與對(duì)比方法檢測結果的(de)一緻性爲 100%（95% 置信區(qū)間：99.66%-100%）。 此外，9747例正常成年人(rén)大(dà)樣本中目标外顯子△△ Ct 分(fēn)布範圍的(de)調查亦顯示，該産品的(de)純合突變判斷界值設置合理(lǐ)。
該試劑目前批準的(de)預期用(yòng)途僅包含純合缺失的(de)檢測，尚不能用(yòng)于雜(zá)合缺失的(de)檢測。因此無法用(yòng)于 SMA攜帶者的(de)篩查。這(zhè)是該産品的(de)缺陷之一。但事實上該産品在設計上已考慮到 SMA 攜帶者的(de)檢測。該産品的(de)檢測原理(lǐ)是以待測樣本中目标外顯子熒光(guāng)信号 Ct 值與内參基因熒光(guāng)信号 Ct 值之差（△ Ct_s），與正常對(duì)照(zhào)品三個(gè)梯度稀釋品中目标外顯子熒光(guāng)信号 Ct 值與内參基因熒光(guāng)信号 Ct 值之差的(de)平均值（△ Ct_a）之差，即△△ Ct，作爲待測樣本中目标外顯子拷貝數檢測變量（△△ Ct= △ Ct_s - △ Ct_a）。 依據實時(shí)熒光(guāng)定量PCR 相對(duì)定量的(de)基本數學原理(lǐ)推導得(de)到申報産品檢測變量△△ Ct 的(de)計算(suàn)公式，依據這(zhè)一計算(suàn)公式可(kě)推導出純合缺失、雜(zá)合缺失和(hé)野生型的(de)△△ Ct 理(lǐ)論值（或範圍）；再結合目标外顯子與内參基因擴增效率差異以及 SMN2 不同拷貝數的(de)影(yǐng)響，可(kě)對(duì)上述△△ Ct 理(lǐ)論值進行優化(huà)；結果顯示純合缺失、雜(zá)合缺失和(hé)野生型的(de)△△ Ct 值（或範圍）之間可(kě)設置合理(lǐ)的(de)判斷界值，因此理(lǐ)論上該産品可(kě)分(fēn)别檢測出三種基因狀态。但鑒于生産企業對(duì)雜(zá)合缺失與野生型之間的(de)判斷界值研究尚不透徹，再加上缺乏可(kě)判定雜(zá)合缺失的(de)對(duì)比方法等其他(tā)困難，本次注冊申請的(de)預期用(yòng)途僅限于檢測純合突變，即 SMA 患者輔助診斷。
小結
綜上，SMN1 基因外顯子缺失檢測在 SMA 疾病診斷和(hé) SMA 攜帶者篩查中具有重要的(de)臨床價值。然而到目前爲止，受到技術水(shuǐ)平的(de)限制，相關的(de)體外診斷試劑比較缺乏，特别是可(kě)用(yòng)于 SMA 攜帶者篩查的(de)雜(zá)合缺失檢測，尚無适合的(de)體外診斷試劑上市。
參考文獻：
【1】王佶等.脊髓性肌萎縮症 SMN1 和(hé)SMN2 基因拷貝數變異分(fēn)析.中國循證兒(ér)科雜(zá)志 ,2013年03期.
【2】張文慧，曹延延等.運用(yòng) MLPA 技術分(fēn)析脊髓性肌萎縮症患兒(ér) SMN1 基因的(de)部分(fēn)缺失.中華醫學雜(zá)志，2015.95（6）.
【3】江雨(yǔ)，周裕林(lín), 脊髓性肌萎縮症SMN1 基因攜帶者篩查技術研究進展.中國産前診斷雜(zá)志（電子版）2013,5(02): 34-39.
審評六部 何靜雲 供稿
人(rén)基因組有兩個(gè)緊鄰的(de)高(gāo)度同源的(de) SMN 基 因：端粒側的(de) SMN1 和(hé)著(zhe)絲粒側的(de) SMN2，兩者僅有 5 個(gè)堿基不同。SMNl 是主要功能基因，該基因突變可(kě)導緻 SMA 發病，SMN2爲臨床表型的(de)調節基因，影(yǐng)響病情的(de)嚴重程度，其拷貝數增加可(kě)減輕SMA 表型。目前已知約 94％的(de) SMA患者爲 SMNl 基因第 7 和(hé)（或）第 8外顯子純合缺失所緻，少數病例可(kě)由SMN1 基因點突變或小的(de)缺失引起。
SMN1 基因外顯子缺失檢測在 SMA 診斷中的(de)意義
SMA 以脊髓前角運動神經元退化(huà)變性爲特征，臨床表現爲進行性、對(duì)稱性四肢近端和(hé)身體軀幹肌肉無力、萎縮和(hé)癱瘓。根據發病年齡和(hé)肌無力嚴重程度，臨床上将 SMA 分(fēn)爲 I、Ⅱ和(hé)Ⅲ型，即嬰兒(ér)型、中間型和(hé)少年型，嚴重程度依次遞減。一般的(de)，神經專科醫生根據發病年齡、臨床表現及病情進展程度進行臨床診斷，輔助檢查方法包括肌電圖、肌酶和(hé)肌肉活檢，結合家族史和(hé) SMN1 基因分(fēn)析可(kě)進行确診。肌電圖是定位診斷，特異度不高(gāo)；肌酶在鑒别其他(tā)肌無力疾病中有參考意義，但對(duì) SMA診斷無特異性；肌肉活檢由于取材的(de)創傷性，患兒(ér)不易接受。由于 SMA患兒(ér)中約 94% 爲 SMN1 基因外顯子純合缺失，因此 SMN1 基因缺失檢測對(duì)于 SMA 的(de)診斷具有更高(gāo)的(de)靈敏度和(hé)特異性，且對(duì)不同型的(de) SMA 患者，SMN1 純合缺失率沒有顯著差異，也(yě)就是說 SMN1 純合缺失的(de)檢測對(duì)于不同型 SMA 患者具有相同的(de)臨床診斷價值；同時(shí)與有創的(de)組織學診斷相比，基因檢測更易被接受。事實上，在歐美(měi)人(rén)群中，SMN1 基因純合缺失檢測已成爲診斷和(hé)排除診斷 SMA 的(de)首選方法。
SMN1 基因外顯子缺失檢測在産前診斷和(hé)篩查中的(de)意義
SMA 在 人(rén) 群 中 的(de) 發 病 率 爲 1/5 000~1/10 000，群體攜帶者頻(pín)率爲 1/35~1/50，是出生缺陷的(de)高(gāo)危因素。由于該病嚴重危害人(rén)類健康，且基因位點明(míng)确，因此極有必要進行SMA 攜帶者的(de)人(rén)群篩查。通(tōng)過 SMN1基因外顯子雜(zá)合缺失突變的(de)檢查可(kě)确認無症狀的(de)攜帶者。當夫妻雙方均爲攜帶者時(shí)，可(kě)對(duì)其進行遺傳咨詢，評估生育患兒(ér)的(de)遺傳風險，并可(kě)以通(tōng)過産前診斷技術降低人(rén)群中 SMA 患兒(ér)的(de)出生率。在歐美(měi)等國家很早就建議(yì)在普通(tōng)人(rén)群中進行 SMA 攜帶者的(de)篩查。
但在 SMA 患兒(ér)臨床診斷和(hé) SMA攜帶者篩查中，對(duì) SMN1 基因外顯子缺失檢測的(de)要求是截然不同的(de)，前者僅需準确檢測出 SMN1 基因外顯子純合缺失，後者則需要鑒别 SMN1 基因外顯子雜(zá)合缺失。
SMN1 基因缺失檢測試劑的(de)現狀
目前，SMN1 基因外顯子缺失檢測試劑較爲缺乏。臨床檢驗實驗室較爲公認的(de)方法是 PCR 結合限制性片段長(cháng)度多(duō)态性（PCR-RFLP）的(de)方法，但該方法操作較爲繁瑣，且重複性差，不利于标準化(huà)，不易推廣。這(zhè)種方法隻能檢測出純合缺失，無法确認雜(zá)合缺失。
荷蘭的(de) SMA MLPA 檢測試劑可(kě)對(duì)待測靶序列進行半定量分(fēn)析，因此既可(kě)檢測純合缺失，亦可(kě)确認雜(zá)合缺失。在國内外已有多(duō)篇文獻報道采用(yòng)該方法進行 SMA 患者診斷和(hé) SMA 攜帶者篩查。但該産品目前仍爲“僅用(yòng)于研究”的(de)試劑，尚未按照(zhào)體外診斷類醫療器械上市（98/79/EC）。
2015 年底，CFDA 批準了(le)第一項SMN1 缺失突變檢測試劑上市。該産品采用(yòng)多(duō)重實時(shí)熒光(guāng) MGB-TaqMan探針 PCR 法，以人(rén)基因組單拷貝基因 RPP40 爲内參基因，對(duì) SMN1 基因第 7 外顯子和(hé)第 8 外顯子拷貝數進行相對(duì)定量檢測，用(yòng)于脊肌萎縮症（SMA）患者的(de)體外輔助分(fēn)子診斷。SMN1 基因外顯子缺失檢測的(de)難點之一在于排除高(gāo)同源性基因 SMN2 的(de)幹擾，特别是對(duì)于 SMN2 高(gāo)拷貝數的(de)受試者，需保證結果的(de)準确可(kě)靠。該産品通(tōng)過對(duì)實時(shí)熒光(guāng) PCR 相對(duì)定量、絕對(duì)定量技術進行系統整合，并在反應體系中加入特定化(huà)學組份，以抑制PCR 引物(wù) 3’端的(de)胞嘧啶（C）與胸腺嘧啶（T）的(de)錯配，增加 PCR 擴增的(de)特異性，從而有效控制 SMN2 基因非特異性擴增對(duì)檢測結果的(de)影(yǐng)響，準确檢出高(gāo)拷貝數 SMN2 樣本中 SMN1基因第7外顯子和(hé)第 8外的(de)缺失情況。
鑒于國内外尚無任何按照(zhào)體外診斷試劑批準上市的(de)SMA 分(fēn)子診斷産品，因此臨床試驗方案中依據 EMQN 關于《SMA 分(fēn)子診斷最佳實踐指南(nán)》，采用(yòng)了(le)國内外SMA 體外輔助分(fēn)子診斷領域公認的(de)PCR-RFLP 法作爲對(duì)照(zhào)方法。臨床試驗共完成 1069 例，其中正常對(duì)照(zhào)組777 例，SMA 病例組 292 例，統計分(fēn)析結果顯示申報産品與對(duì)比方法檢測結果的(de)一緻性爲 100%（95% 置信區(qū)間：99.66%-100%）。 此外，9747例正常成年人(rén)大(dà)樣本中目标外顯子△△ Ct 分(fēn)布範圍的(de)調查亦顯示，該産品的(de)純合突變判斷界值設置合理(lǐ)。
該試劑目前批準的(de)預期用(yòng)途僅包含純合缺失的(de)檢測，尚不能用(yòng)于雜(zá)合缺失的(de)檢測。因此無法用(yòng)于 SMA攜帶者的(de)篩查。這(zhè)是該産品的(de)缺陷之一。但事實上該産品在設計上已考慮到 SMA 攜帶者的(de)檢測。該産品的(de)檢測原理(lǐ)是以待測樣本中目标外顯子熒光(guāng)信号 Ct 值與内參基因熒光(guāng)信号 Ct 值之差（△ Ct_s），與正常對(duì)照(zhào)品三個(gè)梯度稀釋品中目标外顯子熒光(guāng)信号 Ct 值與内參基因熒光(guāng)信号 Ct 值之差的(de)平均值（△ Ct_a）之差，即△△ Ct，作爲待測樣本中目标外顯子拷貝數檢測變量（△△ Ct= △ Ct_s - △ Ct_a）。 依據實時(shí)熒光(guāng)定量PCR 相對(duì)定量的(de)基本數學原理(lǐ)推導得(de)到申報産品檢測變量△△ Ct 的(de)計算(suàn)公式，依據這(zhè)一計算(suàn)公式可(kě)推導出純合缺失、雜(zá)合缺失和(hé)野生型的(de)△△ Ct 理(lǐ)論值（或範圍）；再結合目标外顯子與内參基因擴增效率差異以及 SMN2 不同拷貝數的(de)影(yǐng)響，可(kě)對(duì)上述△△ Ct 理(lǐ)論值進行優化(huà)；結果顯示純合缺失、雜(zá)合缺失和(hé)野生型的(de)△△ Ct 值（或範圍）之間可(kě)設置合理(lǐ)的(de)判斷界值，因此理(lǐ)論上該産品可(kě)分(fēn)别檢測出三種基因狀态。但鑒于生産企業對(duì)雜(zá)合缺失與野生型之間的(de)判斷界值研究尚不透徹，再加上缺乏可(kě)判定雜(zá)合缺失的(de)對(duì)比方法等其他(tā)困難，本次注冊申請的(de)預期用(yòng)途僅限于檢測純合突變，即 SMA 患者輔助診斷。
小結
綜上，SMN1 基因外顯子缺失檢測在 SMA 疾病診斷和(hé) SMA 攜帶者篩查中具有重要的(de)臨床價值。然而到目前爲止，受到技術水(shuǐ)平的(de)限制，相關的(de)體外診斷試劑比較缺乏，特别是可(kě)用(yòng)于 SMA 攜帶者篩查的(de)雜(zá)合缺失檢測，尚無适合的(de)體外診斷試劑上市。
參考文獻：
【1】王佶等.脊髓性肌萎縮症 SMN1 和(hé)SMN2 基因拷貝數變異分(fēn)析.中國循證兒(ér)科雜(zá)志 ,2013年03期.
【2】張文慧，曹延延等.運用(yòng) MLPA 技術分(fēn)析脊髓性肌萎縮症患兒(ér) SMN1 基因的(de)部分(fēn)缺失.中華醫學雜(zá)志，2015.95（6）.
【3】江雨(yǔ)，周裕林(lín), 脊髓性肌萎縮症SMN1 基因攜帶者篩查技術研究進展.中國産前診斷雜(zá)志（電子版）2013,5(02): 34-39.
審評六部 何靜雲 供稿