人(rén)EGFR突變基因檢測試劑注冊申報現狀及共性問題概述
1.前言
人(rén)表皮因子生長(cháng)受體（EGFR）突變基因檢測試劑是指基于位點特異熒光(guāng)-核酸聚合酶鏈式反應（ARMS-PCR法）、基因測序方法等技術，以EGFR突變基因序列爲檢測目标，體外檢測人(rén)體病理(lǐ)組織和(hé)/或外周血等樣本的(de)體外診斷試劑。人(rén)EGFR突變基因是腫瘤個(gè)體化(huà)靶向治療分(fēn)子，目前靶向EGFR突變基因的(de)藥物(wù)主要有兩類：一類是作用(yòng)于EGFR胞外區(qū)的(de)單克隆抗體，阻斷EGFR與配體的(de)結合，從而阻斷下(xià)遊信号轉導途徑；一類是作用(yòng)于胞内酪氨酸激酶活性區(qū)域的(de)小分(fēn)子酪氨酸激酶抑制劑（TKI），如gefitinib和(hé)erlotinib。研究表明(míng)EGFR突變基因在多(duō)種腫瘤細胞中存在，這(zhè)些突變基因是腫瘤患者是否對(duì)TKI敏感的(de)預測因子且被認爲是TKI治療的(de)有效預測指标。
随著(zhe)一代EGFR-TKIs治療藥物(wù)的(de)使用(yòng)，也(yě)發現了(le)一些可(kě)能的(de)耐藥突變，如發生在外顯子20上的(de)替代突變T790M。針對(duì)這(zhè)些耐藥突變，目前也(yě)開發了(le)一些新型藥物(wù)，如針對(duì)T790M耐藥的(de)新藥物(wù)等。此外，還(hái)有許多(duō)類型的(de)突變臨床意義尚不明(míng)确。
2.該類産品注冊審評現狀
在我國依據《體外診斷試劑注冊管理(lǐ)辦法》，人(rén)EGFR突變基因檢測試劑屬于與人(rén)基因檢測相關的(de)試劑，按照(zhào)第三類産品進行管理(lǐ)。在美(měi)國FDA，人(rén)EGFR突變基因檢測試劑被歸爲體細胞突變基因檢測系統，按照(zhào)上市前審批（PMA）管理(lǐ)。檢測人(rén)EGFR突變基因的(de)方法學主要有位點特異PCR熒光(guāng)探針法，基因測序法，數字PCR法等，不同方法學之間在檢測性能方面也(yě)存在明(míng)顯差異。
3.人(rén)EGFR突變基因檢測試劑申報過程中的(de)共性問題
3.1産品說明(míng)書(shū)中預期用(yòng)途的(de)表述
目前該類産品申報說明(míng)書(shū)中存在預期用(yòng)途指向不明(míng)确、表述不清晰等問題。申請人(rén)需規範預期用(yòng)途表述形式，結合該類産品臨床評價數據與腫瘤個(gè)體化(huà)診療藥物(wù)聯合治療情況客觀描述産品預期用(yòng)途。依據《體外診斷試劑産品說明(míng)書(shū)指導原則》要求，預期用(yòng)途需規範EGFR不同突變基因型别表達形式，明(míng)确産品外顯子、突變位點、cosmic代碼等信息。
申請人(rén)需依據自身完成的(de)藥物(wù)診療個(gè)體化(huà)伴随檢測研究工作，注意寫明(míng)申報産品與個(gè)體化(huà)腫瘤藥物(wù)聯合臨床研究相關信息。介紹EGFR突變基因檢測的(de)臨床背景，包括檢測相關适用(yòng)人(rén)群特征、腫瘤組織類型、适用(yòng)樣本類型、待測靶基因序列特征及選擇依據，靶基因及其表達蛋白在惡性腫瘤發生、發展過程中可(kě)能起到作用(yòng)，相關藥物(wù)或其他(tā)治療技術及其作用(yòng)機理(lǐ)、與待測突變位點可(kě)能存在關系等。
3.2臨床研究相關問題
研究表明(míng)，EGFR突變基因被檢測人(rén)群之間存在種族差異。亞裔人(rén)群中非小細胞肺癌患者EGFR突變基因陽性率明(míng)顯高(gāo)于高(gāo)加索人(rén)群，但目前我國人(rén)群腫瘤突變基因數據庫缺乏，申請人(rén)進行該試劑注冊申報前均需完成我國境内臨床研究資料，滿足《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》要求，且需提供EGFR基因型與腫瘤個(gè)體化(huà)治療臨床意義相關研究資料。非小細胞肺癌人(rén)群中，如申報産品部分(fēn)可(kě)檢測基因型未發現存在該類突變基因陽性結果，可(kě)能與該部分(fēn)突變基因在我國人(rén)群突變頻(pín)率較低或總樣本人(rén)群選擇存在偏倚有關。針對(duì)該類問題，建議(yì)申請人(rén)擴大(dà)臨床樣本人(rén)群或根據不同突變基因突變頻(pín)率特點，增加不同地域的(de)臨床研究機構，提高(gāo)這(zhè)部分(fēn)突變基因陽性檢出率。
3.3關于檢測人(rén)外周血樣本相關問題
申報産品中最常見的(de)樣本類型爲中性福爾馬林(lín)固定石蠟包埋病理(lǐ)組織（病理(lǐ)）,且獲取腫瘤基因相關信息的(de)主要來(lái)源仍是腫瘤病理(lǐ)組織樣本。研究結果表明(míng)，随著(zhe)腫瘤細胞的(de)凋亡，腫瘤遊離DNA（ctDNA）片段釋放到人(rén)體血液循環中，通(tōng)過對(duì)外周血腫瘤遊離DNA的(de)檢測解讀，也(yě)可(kě)以較好地了(le)解腫瘤病情的(de)發展情況以及尋找适合的(de)治療方案，尤其對(duì)于那些無法通(tōng)過手術取得(de)腫瘤組織或希望在治療後對(duì)病情進行跟蹤随訪的(de)人(rén)群，是一種理(lǐ)想和(hé)有效的(de)檢測手段。但由于血液遊離DNA含量及變異情況會随著(zhe)腫瘤病情的(de)發展、轉移性腫瘤的(de)發生以及用(yòng)藥治療情況發生實時(shí)的(de)變化(huà)，外周血檢測EGFR突變基因檢測結果存在一定的(de)不确定性。兩種樣本在用(yòng)于人(rén)EGFR-TIK治療效果也(yě)存在差異。
鑒于上述原因，人(rén)EGFR突變基因檢測試劑如适用(yòng)于外周血樣本檢測人(rén)群，預期用(yòng)途需限定爲晚期NSCLC患者，且作爲不能獲取NSCLC組織樣本時(shí)的(de)補充手段。鑒于病理(lǐ)組織樣本和(hé)外周血樣本中EGFR突變基因比例不同，申報産品需分(fēn)别對(duì)檢測外周血樣本和(hé)病例組織樣本進行最低檢出限的(de)研究。
3.4關于适用(yòng)樣本采集儲存相關問題
病理(lǐ)組織樣本需詳細介紹組織學樣本類型，包括樣本來(lái)源及取材要求、組織标本采集厚度、樣本處理(lǐ)方式（如組織樣本的(de)固定及包埋方式）、腫瘤細胞比例等。在對(duì)核酸序列進行檢測前，需對(duì)用(yòng)于腫瘤組織突變基因檢測的(de)标本進行評估，并富集存在EGFR突變基因的(de)腫瘤細胞用(yòng)于核酸提取。腫瘤細胞所占比例需達到所用(yòng)檢測方法的(de)要求。
外周血采集後，需通(tōng)過驗證試驗規定外周血存放條件以及存放時(shí)限及溫度設置等，包括采用(yòng)加入抗核酸降解的(de)采血管要求。樣本采集管或保存管中所用(yòng)的(de)防腐劑、抗凝劑、保護劑等輔助成分(fēn)不應對(duì)基因序列擴增産生幹擾。血液通(tōng)常需要先進行抗凝保存，應關注抗凝劑的(de)選擇。申請人(rén)需對(duì)抗凝劑、防腐劑、保護劑等成分(fēn)進行驗證。
因外周血中ctDNA含量低，爲提高(gāo)EGFR突變基因檢出率，在臨床允許的(de)情況下(xià)推薦增加血漿用(yòng)量。抽血後延遲血漿分(fēn)離會導緻血細胞裂解，釋放出基因組DNA（gDNA）至血漿中；大(dà)量增加的(de)gDNA會稀釋腫瘤來(lái)源的(de)ctDNA，使得(de)突變難以檢出。因此在标本采集、運輸及儲存過程中，防止遊離DNA降解是首要考慮因素；其次，也(yě)應防止血液中白細胞裂解，避免因野生型DNA增加導緻ctDNA中EGFR突變基因無法檢測。
3.5産品研發申報難點
人(rén)EGFR突變基因檢測試劑聯合治療産品使用(yòng)，用(yòng)于指導用(yòng)藥或者預後判斷，該類産品屬于伴随診斷産品，與治療藥物(wù)使用(yòng)安全有效密切相關。美(měi)國FDA曾發布伴随診斷産品指導文件，鼓勵申請人(rén)同步進行治療産品與伴随診斷産品研發與上市前申請。我中心鼓勵申請人(rén)在伴随診斷試劑研發時(shí)應充分(fēn)聯合治療藥物(wù)對(duì)産品進行臨床評價。但國内具體開發創新性腫瘤個(gè)體化(huà)藥物(wù)的(de)生産企業較少，目前多(duō)爲國外專利期到期後腫瘤個(gè)體化(huà)藥物(wù)的(de)仿制藥研究。這(zhè)也(yě)給從事該類體外診斷試劑的(de)生産企業開展創新性腫瘤個(gè)體化(huà)伴随臨床研究帶來(lái)困難。
4.小結
人(rén)EGFR突變基因檢測目前是EGFR-TKIs治療的(de)重要檢測靶點，随著(zhe)核酸檢測技術的(de)發展，如：BEAMing技術、數字PCR、高(gāo)通(tōng)量測序技術運用(yòng)于腫瘤個(gè)體化(huà)治療，相關突變基因檢測越來(lái)越受到臨床專家和(hé)行業研究人(rén)員(yuán)關注。不同于目前臨床常規成熟且推薦的(de)檢測技術，新的(de)檢測技術如何定位、臨床個(gè)體化(huà)應用(yòng)與臨床個(gè)體化(huà)研究兩者存在差異、臨床轉化(huà)醫學研究如何有效轉化(huà)爲臨床應用(yòng)，都将是今後注冊審評關注重點。
參考文獻：
1. FDA,In Vitro Companion Diagnostic Devices,Guidance for Industry and Food and Drug Administration Staff, 2014-08-06.
2.《非小細胞肺癌血液EGFR基因突變檢測中國專家共識》制定專家組.非小細胞肺癌血液EGFR基因突變檢測中國專家共識. 中華醫學雜(zá)志2015年12月(yuè)8日第95卷第46期
3.中國醫師協會腫瘤醫師分(fēn)會，中國抗癌協會腫瘤臨床化(huà)療專業委員(yuán)會.中國表皮生長(cháng)因子受體基因敏感突變和(hé)間變淋巴瘤激酶融合基因陽性非小細胞肺癌診斷治療指南(nán)(2014版) 中華腫瘤雜(zá)志2014年7月(yuè)第36卷第7期
審評六部 吳傳松供稿
人(rén)表皮因子生長(cháng)受體（EGFR）突變基因檢測試劑是指基于位點特異熒光(guāng)-核酸聚合酶鏈式反應（ARMS-PCR法）、基因測序方法等技術，以EGFR突變基因序列爲檢測目标，體外檢測人(rén)體病理(lǐ)組織和(hé)/或外周血等樣本的(de)體外診斷試劑。人(rén)EGFR突變基因是腫瘤個(gè)體化(huà)靶向治療分(fēn)子，目前靶向EGFR突變基因的(de)藥物(wù)主要有兩類：一類是作用(yòng)于EGFR胞外區(qū)的(de)單克隆抗體，阻斷EGFR與配體的(de)結合，從而阻斷下(xià)遊信号轉導途徑；一類是作用(yòng)于胞内酪氨酸激酶活性區(qū)域的(de)小分(fēn)子酪氨酸激酶抑制劑（TKI），如gefitinib和(hé)erlotinib。研究表明(míng)EGFR突變基因在多(duō)種腫瘤細胞中存在，這(zhè)些突變基因是腫瘤患者是否對(duì)TKI敏感的(de)預測因子且被認爲是TKI治療的(de)有效預測指标。
随著(zhe)一代EGFR-TKIs治療藥物(wù)的(de)使用(yòng)，也(yě)發現了(le)一些可(kě)能的(de)耐藥突變，如發生在外顯子20上的(de)替代突變T790M。針對(duì)這(zhè)些耐藥突變，目前也(yě)開發了(le)一些新型藥物(wù)，如針對(duì)T790M耐藥的(de)新藥物(wù)等。此外，還(hái)有許多(duō)類型的(de)突變臨床意義尚不明(míng)确。
2.該類産品注冊審評現狀
在我國依據《體外診斷試劑注冊管理(lǐ)辦法》，人(rén)EGFR突變基因檢測試劑屬于與人(rén)基因檢測相關的(de)試劑，按照(zhào)第三類産品進行管理(lǐ)。在美(měi)國FDA，人(rén)EGFR突變基因檢測試劑被歸爲體細胞突變基因檢測系統，按照(zhào)上市前審批（PMA）管理(lǐ)。檢測人(rén)EGFR突變基因的(de)方法學主要有位點特異PCR熒光(guāng)探針法，基因測序法，數字PCR法等，不同方法學之間在檢測性能方面也(yě)存在明(míng)顯差異。
3.人(rén)EGFR突變基因檢測試劑申報過程中的(de)共性問題
3.1産品說明(míng)書(shū)中預期用(yòng)途的(de)表述
目前該類産品申報說明(míng)書(shū)中存在預期用(yòng)途指向不明(míng)确、表述不清晰等問題。申請人(rén)需規範預期用(yòng)途表述形式，結合該類産品臨床評價數據與腫瘤個(gè)體化(huà)診療藥物(wù)聯合治療情況客觀描述産品預期用(yòng)途。依據《體外診斷試劑産品說明(míng)書(shū)指導原則》要求，預期用(yòng)途需規範EGFR不同突變基因型别表達形式，明(míng)确産品外顯子、突變位點、cosmic代碼等信息。
申請人(rén)需依據自身完成的(de)藥物(wù)診療個(gè)體化(huà)伴随檢測研究工作，注意寫明(míng)申報産品與個(gè)體化(huà)腫瘤藥物(wù)聯合臨床研究相關信息。介紹EGFR突變基因檢測的(de)臨床背景，包括檢測相關适用(yòng)人(rén)群特征、腫瘤組織類型、适用(yòng)樣本類型、待測靶基因序列特征及選擇依據，靶基因及其表達蛋白在惡性腫瘤發生、發展過程中可(kě)能起到作用(yòng)，相關藥物(wù)或其他(tā)治療技術及其作用(yòng)機理(lǐ)、與待測突變位點可(kě)能存在關系等。
3.2臨床研究相關問題
研究表明(míng)，EGFR突變基因被檢測人(rén)群之間存在種族差異。亞裔人(rén)群中非小細胞肺癌患者EGFR突變基因陽性率明(míng)顯高(gāo)于高(gāo)加索人(rén)群，但目前我國人(rén)群腫瘤突變基因數據庫缺乏，申請人(rén)進行該試劑注冊申報前均需完成我國境内臨床研究資料，滿足《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》要求，且需提供EGFR基因型與腫瘤個(gè)體化(huà)治療臨床意義相關研究資料。非小細胞肺癌人(rén)群中，如申報産品部分(fēn)可(kě)檢測基因型未發現存在該類突變基因陽性結果，可(kě)能與該部分(fēn)突變基因在我國人(rén)群突變頻(pín)率較低或總樣本人(rén)群選擇存在偏倚有關。針對(duì)該類問題，建議(yì)申請人(rén)擴大(dà)臨床樣本人(rén)群或根據不同突變基因突變頻(pín)率特點，增加不同地域的(de)臨床研究機構，提高(gāo)這(zhè)部分(fēn)突變基因陽性檢出率。
3.3關于檢測人(rén)外周血樣本相關問題
申報産品中最常見的(de)樣本類型爲中性福爾馬林(lín)固定石蠟包埋病理(lǐ)組織（病理(lǐ)）,且獲取腫瘤基因相關信息的(de)主要來(lái)源仍是腫瘤病理(lǐ)組織樣本。研究結果表明(míng)，随著(zhe)腫瘤細胞的(de)凋亡，腫瘤遊離DNA（ctDNA）片段釋放到人(rén)體血液循環中，通(tōng)過對(duì)外周血腫瘤遊離DNA的(de)檢測解讀，也(yě)可(kě)以較好地了(le)解腫瘤病情的(de)發展情況以及尋找适合的(de)治療方案，尤其對(duì)于那些無法通(tōng)過手術取得(de)腫瘤組織或希望在治療後對(duì)病情進行跟蹤随訪的(de)人(rén)群，是一種理(lǐ)想和(hé)有效的(de)檢測手段。但由于血液遊離DNA含量及變異情況會随著(zhe)腫瘤病情的(de)發展、轉移性腫瘤的(de)發生以及用(yòng)藥治療情況發生實時(shí)的(de)變化(huà)，外周血檢測EGFR突變基因檢測結果存在一定的(de)不确定性。兩種樣本在用(yòng)于人(rén)EGFR-TIK治療效果也(yě)存在差異。
鑒于上述原因，人(rén)EGFR突變基因檢測試劑如适用(yòng)于外周血樣本檢測人(rén)群，預期用(yòng)途需限定爲晚期NSCLC患者，且作爲不能獲取NSCLC組織樣本時(shí)的(de)補充手段。鑒于病理(lǐ)組織樣本和(hé)外周血樣本中EGFR突變基因比例不同，申報産品需分(fēn)别對(duì)檢測外周血樣本和(hé)病例組織樣本進行最低檢出限的(de)研究。
3.4關于适用(yòng)樣本采集儲存相關問題
病理(lǐ)組織樣本需詳細介紹組織學樣本類型，包括樣本來(lái)源及取材要求、組織标本采集厚度、樣本處理(lǐ)方式（如組織樣本的(de)固定及包埋方式）、腫瘤細胞比例等。在對(duì)核酸序列進行檢測前，需對(duì)用(yòng)于腫瘤組織突變基因檢測的(de)标本進行評估，并富集存在EGFR突變基因的(de)腫瘤細胞用(yòng)于核酸提取。腫瘤細胞所占比例需達到所用(yòng)檢測方法的(de)要求。
外周血采集後，需通(tōng)過驗證試驗規定外周血存放條件以及存放時(shí)限及溫度設置等，包括采用(yòng)加入抗核酸降解的(de)采血管要求。樣本采集管或保存管中所用(yòng)的(de)防腐劑、抗凝劑、保護劑等輔助成分(fēn)不應對(duì)基因序列擴增産生幹擾。血液通(tōng)常需要先進行抗凝保存，應關注抗凝劑的(de)選擇。申請人(rén)需對(duì)抗凝劑、防腐劑、保護劑等成分(fēn)進行驗證。
因外周血中ctDNA含量低，爲提高(gāo)EGFR突變基因檢出率，在臨床允許的(de)情況下(xià)推薦增加血漿用(yòng)量。抽血後延遲血漿分(fēn)離會導緻血細胞裂解，釋放出基因組DNA（gDNA）至血漿中；大(dà)量增加的(de)gDNA會稀釋腫瘤來(lái)源的(de)ctDNA，使得(de)突變難以檢出。因此在标本采集、運輸及儲存過程中，防止遊離DNA降解是首要考慮因素；其次，也(yě)應防止血液中白細胞裂解，避免因野生型DNA增加導緻ctDNA中EGFR突變基因無法檢測。
3.5産品研發申報難點
人(rén)EGFR突變基因檢測試劑聯合治療産品使用(yòng)，用(yòng)于指導用(yòng)藥或者預後判斷，該類産品屬于伴随診斷産品，與治療藥物(wù)使用(yòng)安全有效密切相關。美(měi)國FDA曾發布伴随診斷産品指導文件，鼓勵申請人(rén)同步進行治療産品與伴随診斷産品研發與上市前申請。我中心鼓勵申請人(rén)在伴随診斷試劑研發時(shí)應充分(fēn)聯合治療藥物(wù)對(duì)産品進行臨床評價。但國内具體開發創新性腫瘤個(gè)體化(huà)藥物(wù)的(de)生産企業較少，目前多(duō)爲國外專利期到期後腫瘤個(gè)體化(huà)藥物(wù)的(de)仿制藥研究。這(zhè)也(yě)給從事該類體外診斷試劑的(de)生産企業開展創新性腫瘤個(gè)體化(huà)伴随臨床研究帶來(lái)困難。
4.小結
人(rén)EGFR突變基因檢測目前是EGFR-TKIs治療的(de)重要檢測靶點，随著(zhe)核酸檢測技術的(de)發展，如：BEAMing技術、數字PCR、高(gāo)通(tōng)量測序技術運用(yòng)于腫瘤個(gè)體化(huà)治療，相關突變基因檢測越來(lái)越受到臨床專家和(hé)行業研究人(rén)員(yuán)關注。不同于目前臨床常規成熟且推薦的(de)檢測技術，新的(de)檢測技術如何定位、臨床個(gè)體化(huà)應用(yòng)與臨床個(gè)體化(huà)研究兩者存在差異、臨床轉化(huà)醫學研究如何有效轉化(huà)爲臨床應用(yòng)，都将是今後注冊審評關注重點。
參考文獻：
1. FDA,In Vitro Companion Diagnostic Devices,Guidance for Industry and Food and Drug Administration Staff, 2014-08-06.
2.《非小細胞肺癌血液EGFR基因突變檢測中國專家共識》制定專家組.非小細胞肺癌血液EGFR基因突變檢測中國專家共識. 中華醫學雜(zá)志2015年12月(yuè)8日第95卷第46期
3.中國醫師協會腫瘤醫師分(fēn)會，中國抗癌協會腫瘤臨床化(huà)療專業委員(yuán)會.中國表皮生長(cháng)因子受體基因敏感突變和(hé)間變淋巴瘤激酶融合基因陽性非小細胞肺癌診斷治療指南(nán)(2014版) 中華腫瘤雜(zá)志2014年7月(yuè)第36卷第7期
審評六部 吳傳松供稿