本指導原則旨在指導注冊申請人(rén)對(duì)乙型肝炎病毒耐藥相關的(de)基因突變檢測試劑注冊申報資料的(de)準備及撰寫，同時(shí)也(yě)爲技術審評部門對(duì)注冊申報資料的(de)技術審評提供參考。

本指導原則是針對(duì)乙型肝炎病毒耐藥相關的(de)基因突變檢測試劑的(de)一般要求，申請人(rén)應依據産品的(de)具體特性确定其中内容是否适用(yòng)，若不适用(yòng)，需具體闡述理(lǐ)由及相應的(de)科學依據，并依據産品的(de)具體特性對(duì)注冊申報資料的(de)内容進行充實和(hé)細化(huà)。

本指導原則是供申請人(rén)和(hé)審查人(rén)員(yuán)使用(yòng)的(de)指導性文件，不涉及注冊審批等行政事項，亦不作爲法規強制執行，如有能夠滿足法規要求的(de)其他(tā)方法，也(yě)可(kě)以采用(yòng)，但應提供詳細的(de)研究資料和(hé)驗證資料。應在遵循相關法規的(de)前提下(xià)使用(yòng)本指導原則。

本指導原則是在現行法規、标準體系及當前認知水(shuǐ)平下(xià)制定的(de)，随著(zhe)法規、标準的(de)不斷完善和(hé)科學技術的(de)不斷發展，本指導原則相關内容也(yě)将适時(shí)進行調整。

适用(yòng)範圍

（一）臨床背景

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染呈世界性流行，但不同地區(qū)HBV 感染的(de)流行強度差異很大(dà)。全國2006年乙型肝炎血清流行病學調查表明(míng)，我國1-59歲一般人(rén)群乙型肝炎表面抗原（Hepatitis B surface antigen，HBsAg）陽性率爲7.18%，2014年中國疾病預防控制中心開展的(de)全國1—29歲人(rén)群乙型肝炎血清流行病學調查結果顯示，1—4歲、5—14歲、15—29歲人(rén)群HBsAg陽性率分(fēn)别爲0.32%、0.94%和(hé)4.38%，我國現有HBV感染者約有8000萬。在臨床治療慢(màn)性乙型肝炎病毒感染的(de)方案中，使用(yòng)抗病毒藥物(wù)是最主要的(de)手段。抗HBV藥物(wù)主要包括幹擾素α和(hé)核苷（酸）類似物(wù)兩大(dà)類，其中核苷（酸）類藥物(wù)服用(yòng)便捷，抗病毒效力強，不良反應較小，但核苷（酸）類藥物(wù)在抗HBV治療中需要長(cháng)期服藥，一旦出現病毒耐藥，可(kě)能導緻治療失敗、病毒DNA反彈、肝功能惡化(huà)甚至肝衰竭。因此，如何發現病毒耐藥突變，進而合理(lǐ)調整治療方案，在慢(màn)性乙型肝炎臨床治療中具有極其重要的(de)意義。

HBV屬于嗜肝DNA病毒科（hepadnaviridae），HBV基因組含有4個(gè)部分(fēn)重疊的(de)開放讀框（ORF），即前-S/S區(qū)、前-C/C 區(qū)、P區(qū)和(hé)X區(qū)。其中P區(qū)編碼聚合酶/逆轉錄酶，目前已知的(de)核苷（酸）類藥物(wù)的(de)耐藥突變均發生在HBV的(de)P區(qū)。HBV雖然屬于DNA病毒，但其複制需經過以前基因組RNA爲複制中間體的(de)逆轉錄過程。在此過程中，HBV逆轉錄酶由于缺乏嚴格的(de)校正機制，導緻HBV複制過程中核苷酸錯配率較高(gāo)。HBV複制的(de)這(zhè)種過程和(hé)特點，導緻同一患者體内不同的(de)HBV株基因序列之間也(yě)存在差異，因此，每一個(gè)患者體内的(de)病毒都是由不同基因序列的(de)病毒株組成的(de)動态變化(huà)的(de)病毒準種，不同基因序列的(de)病毒株在病毒準種中所占的(de)相對(duì)比例，一方面取決于病毒株自身的(de)複制能力，另一方面也(yě)受到機體免疫系統或藥物(wù)的(de)選擇壓力的(de)影(yǐng)響。

抗病毒藥物(wù)核苷（酸）類似物(wù)進入機體後，形成三磷酸活性成分(fēn)，與機體天然的(de)脫氧三磷酸核苷（dNTP）競争性結合到HBV聚合酶上，使HBV的(de)DNA鏈合成終止。如果患者體内的(de)HBV P區(qū)序列發生突變，導緻産生的(de)HBV聚合酶與核苷（酸）類似物(wù)結合力降低，突變的(de)HBV即不受核苷（酸）類似物(wù)的(de)抑制或抑制能力下(xià)降，在繼續應用(yòng)核苷（酸）類似物(wù)治療的(de)情況下(xià)，突變株病毒由于對(duì)核苷（酸）類似物(wù)不敏感而逐漸成爲優勢株，從而導緻患者對(duì)于核苷（酸）類似物(wù)的(de)耐藥。

乙型肝炎病毒的(de)耐藥突變分(fēn)爲原發性耐藥突變和(hé)補償性耐藥突變，原發性耐藥突變指藥物(wù)作用(yòng)靶位的(de)基因及其編碼的(de)氨基酸發生突變，導緻突變病毒株對(duì)治療藥物(wù)的(de)敏感性下(xià)降。雖然原發性耐藥突變株對(duì)藥物(wù)的(de)抵抗性增加，但也(yě)常導緻突變病毒本身的(de)複制能力下(xià)降。補償性耐藥突變指由于原發性耐藥突變病毒株複制能力下(xià)降，在原發性耐藥突變的(de)基礎上，病毒株在其它位點發生突變，這(zhè)些突變可(kě)部分(fēn)恢複突變病毒的(de)複制能力或可(kě)導緻突變病毒對(duì)藥物(wù)敏感性的(de)進一步下(xià)降。

目前經國家藥品監督管理(lǐ)局批準用(yòng)于抗HBV治療的(de)核苷（酸）類似物(wù)有拉米夫定（LAM）、阿德福韋酯（ADV）、恩替卡韋（ETV）、替比夫定（LdT）、替諾福韋酯（TDF）和(hé)富馬酸丙酚替諾福韋（TAF）等。與拉米夫定常見耐藥相關的(de)突變爲rtM204I/V和(hé)rtL180M，其中rtM204V多(duō)與rtL180M聯合出現，rtM204I可(kě)單獨出現。與阿德福韋酯常見耐藥相關的(de)突變爲rtN236T與rtA181V/T，兩個(gè)位點可(kě)單獨或聯合出現。與恩替卡韋常見耐藥相關的(de)突變是在rtM204V+rtL180M基礎上，再聯合rtT184、rtS202或rtM250三個(gè)位點中至少一個(gè)位點的(de)氨基酸替代突變。與替比夫定常見耐藥相關的(de)突變爲rtM204I，其它位點如rtA181V/T等尚存在争議(yì)。替諾福韋酯和(hé)富馬酸丙酚替諾福韋目前尚未發現确認的(de)耐藥突變。

HBV耐藥相關的(de)檢測主要包括基因型耐藥檢測和(hé)體外表型分(fēn)析等。

HBV基因型耐藥檢測是指采用(yòng)分(fēn)子生物(wù)學方法檢測已在體外表型分(fēn)析中被證實與抗病毒藥物(wù)耐藥相關的(de)HBV突變的(de)臨床檢測。目前已批準産品采用(yòng)的(de)方法主要包括：PCR-測序法（direct PCR sequencing）、基因芯片法（gene chip）、PCR-反向雜(zá)交法（PCR-reverse hybridization assay）、實時(shí)熒光(guāng)PCR法（real-time PCR）等。

HBV體外表型分(fēn)析（in vitro phenotypic analysis）是公認的(de)确認耐藥的(de)檢測方法，通(tōng)過體外複制系統證實檢測到的(de)HBV突變會降低其對(duì)抗病毒藥物(wù)的(de)敏感性，常用(yòng)半數有效濃度（50% effective concentration，EC50）或半數抑制濃度（50% inhibitory concentration，IC50）來(lái)評價耐藥程度的(de)高(gāo)低。其方法是将含有待檢測耐藥突變位點的(de)HBV全基因組導入肝細胞來(lái)源的(de)細胞系，再将不同濃度梯度的(de)核苷（酸）類似物(wù)加入細胞培養液中，經過一定培養時(shí)間後檢測藥物(wù)作用(yòng)下(xià)HBV DNA的(de)複制情況，計算(suàn)EC50，通(tōng)過與野生株病毒的(de)EC50比較，判斷該突變對(duì)核苷（酸）類似物(wù)的(de)敏感性。當抑制病毒複制所需的(de)EC50與野生株相比增加l00倍以上稱爲高(gāo)度耐藥、l0—99倍爲中度耐藥、2—9倍爲輕度耐藥。

（二）本指導原則适用(yòng)範圍

本指導原則所述乙型肝炎病毒耐藥相關的(de)基因突變檢測試劑是指利用(yòng)分(fēn)子生物(wù)學技術，對(duì)人(rén)體血清/血漿樣本中乙型肝炎病毒耐藥突變位點進行定性檢測的(de)試劑。臨床适用(yòng)人(rén)群爲核苷（酸）類似物(wù)治療過程中出現病毒學突破的(de)患者。除非有明(míng)确證據表明(míng)初治患者感染HBV來(lái)自接受核苷（酸）類似物(wù)抗病毒治療患者，一般不主張對(duì)初治患者進行基因型耐藥檢測。

本指導原則是基于實時(shí)熒光(guāng)PCR方法對(duì)産品相關申報資料提出要求，其他(tā)方法學的(de)産品可(kě)依據産品特性确定其中具體内容是否适用(yòng)，如不适用(yòng)，可(kě)另行選擇符合自身方法學特性的(de)技術要求或評價方法。

本指導原則适用(yòng)于進行産品注冊和(hé)相關許可(kě)事項變更的(de)産品。其他(tā)未盡事宜應當符合《體外診斷試劑注冊管理(lǐ)辦法》（國家食品藥品監督管理(lǐ)總局令第5号）（以下(xià)簡稱《辦法》）等相關法規要求。

詳細内容，見https://www.cmde.org.cn/CL0112/20613.html